結(jie)合(he)物(wu)(wu)即酶標記(ji)的(de)(de)(de)抗(kang)體（或(huo)抗(kang)原），是ELISA中(zhong)至關重要(yao)的(de)(de)(de)關鍵的(de)(de)(de)試劑。良(liang)(liang)好的(de)(de)(de)結(jie)合(he)物(wu)(wu)應(ying)該是既保有(you)(you)酶的(de)(de)(de)催(cui)化活(huo)性，也保持(chi)了抗(kang)體（或(huo)抗(kang)原）的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)活(huo)性。結(jie)合(he)物(wu)(wu)中(zhong)酶與抗(kang)體（或(huo)抗(kang)原）之間有(you)(you)恰當的(de)(de)(de)分子比例，在結(jie)合(he)試劑中(zhong)應(ying)盡量不含有(you)(you)或(huo)少含有(you)(you)游(you)離的(de)(de)(de)（未(wei)結(jie)合(he)的(de)(de)(de)）酶或(huo)游(you)離的(de)(de)(de)抗(kang)體（或(huo)抗(kang)原），此外，結(jie)合(he)物(wu)(wu)尚要(yao)有(you)(you)良(liang)(liang)好的(de)(de)(de)穩定性。 ;
用于ELISA的酶應符合以下要(yao)求：
①純度高
②催(cui)化反應(ying)的轉化率高(gao)
③一性強
④性質穩(wen)定(ding)
⑤來(lai)源(yuan)豐富
⑥價(jia)格不貴(gui)
⑦制備成酶結(jie)合物后(hou)仍繼續(xu)保存(cun)它的活性部分和催化能(neng)力
⑧在(zai)受檢標本中不(bu)存在(zai)相同的酶
⑨相應底物易于制備和保存(cun)，價格低廉，有色產物易于測定等
在(zai)ELISA中，常用(yong)的(de)酶(mei)(mei)(mei)為(wei)辣根過氧化物酶(mei)(mei)(mei)和(he)堿性磷酸酶(mei)(mei)(mei)。在(zai)少數(shu)商品ELISA試劑(ji)中，應用(yong)的(de)酶(mei)(mei)(mei)尚有葡萄糖氧化酶(mei)(mei)(mei)、β-D-半(ban)乳糖苷酶(mei)(mei)(mei)和(he)脲酶(mei)(mei)(mei)等。國產ELISA試劑(ji)一(yi)般都用(yong)HRP制(zhi)備結合(he)物。HRP是一(yi)種糖蛋(dan)白，含糖量約(yue)為(wei)18%，分子量為(wei)44000，是一(yi)種復合(he)酶(mei)(mei)(mei)，由主(zhu)酶(mei)(mei)(mei)（酶(mei)(mei)(mei)蛋(dan)白）和(he)輔基(ji)（亞鐵血紅素）結合(he)而成，是一(yi)種卟啉(lin)蛋(dan)白質。主(zhu)酶(mei)(mei)(mei)無色糖蛋(dan)白在(zai)275nm波(bo)優(you)點有高吸(xi)收峰(feng)，輔基(ji)是深棕色的(de)含鐵卟啉(lin)環(huan)，在(zai)403nm波(bo)優(you)點有高吸(xi)收峰(feng)。HRP的(de)純(chun)度用(yong)RZ(Reinheit Zahl，德(de)文，意為(wei)純(chun)度數(shu)）表示，是403nm的(de)吸(xi)光度與280nm吸(xi)光度之比(bi)，高純(chun)度的(de)HRP的(de)RZ≥7.0。
HRP除(chu)符合上述的(de)(de)ELISA中標記酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)要(yao)求外，更有(you)價格(ge)低廉和性(xing)質較穩定的(de)(de)特點。值得(de)留意的(de)(de)是，在選(xuan)用酶(mei)(mei)(mei)制劑時，除(chu)其純(chun)度(du)RZ外，更應留意酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)活(huo)力。高純(chun)度(du)的(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)如保存不當，活(huo)力也會降低。酶(mei)(mei)(mei)制劑的(de)(de)活(huo)力以(yi)所含(han)的(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)活(huo)力單位表(biao)示，可用對底物(wu)作用后天生(sheng)產物(wu)量的(de)(de)測定進行(xing)試驗。
國外(wai)很多(duo)ELISA試(shi)劑采(cai)用(yong)(yong)堿(jian)性(xing)磷酸酶（AP）作(zuo)(zuo)為標(biao)記酶。常用(yong)(yong)的AP有兩個來源(yuan)，分別從(cong)大腸(chang)桿菌(jun)和小(xiao)(xiao)牛腸(chang)膜中提(ti)(ti)取。不同來源(yuan)的酶生化特性(xing)特性(xing)略不相同，從(cong)大腸(chang)桿菌(jun)中提(ti)(ti)取的AP分子量為80000，酶作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)的適合pH為8.0；用(yong)(yong)小(xiao)(xiao)牛腸(chang)膜中提(ti)(ti)取的AP分子量為100000，適宜pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tong)的敏(min)感度一般(ban)高于HRP系統(tong)，空缺值也(ye)較低，但AP價格昂貴(gui)，制備(bei)結合物(wu)所得(de)率也(ye)較HRP低。
制(zhi)備結(jie)(jie)合(he)物(wu)(wu)時所用抗(kang)體一(yi)般 均為純(chun)度(du)較(jiao)高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)IgG，以(yi)免(mian)在與酶(mei)(mei)聯結(jie)(jie)時其他雜蛋白的(de)(de)(de)(de)干(gan)擾(rao)。用親和層(ceng)析純(chun)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)體，這樣全部酶(mei)(mei)結(jie)(jie)合(he)物(wu)(wu)均具有(you)特(te)異的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫活性，可以(yi)在高(gao)(gao)稀(xi)釋度(du)進行反應，實驗結(jie)(jie)果(guo)本底淺(qian)淡。如用F(ab)2進行標記，則更可避免(mian)標本中RF的(de)(de)(de)(de)干(gan)擾(rao)。在ELISA中用酶(mei)(mei)標抗(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)(de)模式未(wei)幾，總的(de)(de)(de)(de)要求(qiu)是抗(kang)原(yuan)必須是高(gao)(gao)純(chun)度(du)的(de)(de)(de)(de)。
用于稀(xi)釋(shi)(shi)高(gao)濃(nong)度的(de)結(jie)(jie)(jie)合物以配成工(gong)作(zuo)液。為(wei)避免結(jie)(jie)(jie)合物在(zai)反應中(zhong)直接吸附(fu)在(zai)固相(xiang)載體(ti)上(shang)，在(zai)稀(xi)釋(shi)(shi)緩沖液中(zhong)常加進(jin)高(gao)濃(nong)度的(de)無關蛋(dan)白質（例(li)如(ru)1%牛血清白蛋(dan)白），通過競爭以抑(yi)(yi)制結(jie)(jie)(jie)合物的(de)吸附(fu)。一般還(huan)加進(jin)具有抑(yi)(yi)制蛋(dan)白質吸附(fu)于塑(su)料表(biao)面的(de)非(fei)離子型表(biao)面活性劑(ji)，如(ru)吐溫20，0.05%的(de)濃(nong)度較(jiao)為(wei)適(shi)宜。在(zai)間(jian)接測(ce)定抗體(ti)時，血清標本需稀(xi)釋(shi)(shi)后進(jin)行測(ce)定，也可應用這種稀(xi)釋(shi)(shi)液。
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