結(jie)合物(wu)即酶標記的(de)抗(kang)(kang)體(ti)（或抗(kang)(kang)原），是(shi)ELISA中(zhong)至(zhi)關(guan)重要的(de)關(guan)鍵的(de)試劑(ji)。良好的(de)結(jie)合物(wu)應(ying)該是(shi)既保有(you)酶的(de)催化活性，也保持了(le)抗(kang)(kang)體(ti)（或抗(kang)(kang)原）的(de)免疫活性。結(jie)合物(wu)中(zhong)酶與(yu)抗(kang)(kang)體(ti)（或抗(kang)(kang)原）之(zhi)間有(you)恰當的(de)分(fen)子比(bi)例(li)，在(zai)結(jie)合試劑(ji)中(zhong)應(ying)盡量不含(han)有(you)或少含(han)有(you)游(you)離的(de)（未結(jie)合的(de)）酶或游(you)離的(de)抗(kang)(kang)體(ti)（或抗(kang)(kang)原），此外，結(jie)合物(wu)尚要有(you)良好的(de)穩定性。
用于ELISA的酶應符(fu)合以下要(yao)求：
①純度高
②催(cui)化(hua)反應的轉(zhuan)化(hua)率(lv)高
③一(yi)性強
④性質穩定
⑤來源豐富
⑥價格不(bu)貴
⑦制備(bei)成(cheng)酶結合物(wu)后(hou)仍繼續保存(cun)它的活性部分和催化能力(li)
⑧在受(shou)檢標本(ben)中不存(cun)在相同的酶
⑨相應底物(wu)易(yi)(yi)于(yu)制備和(he)保存，價格(ge)低廉(lian)，有色產物(wu)易(yi)(yi)于(yu)測定等
在(zai)(zai)ELISA中(zhong)，常用(yong)的酶為辣(la)根(gen)過氧化物(wu)(wu)酶和堿性磷酸酶。在(zai)(zai)少數(shu)商品ELISA試劑(ji)中(zhong)，應用(yong)的酶尚有(you)葡萄(tao)糖(tang)氧化酶、β-D-半乳糖(tang)苷酶和脲酶等。國產(chan)ELISA試劑(ji)一般都用(yong)HRP制備結(jie)合物(wu)(wu)。HRP是(shi)一種糖(tang)蛋(dan)白，含(han)糖(tang)量(liang)約為18%，分子量(liang)為44000，是(shi)一種復合酶，由主酶（酶蛋(dan)白）和輔基（亞(ya)鐵血紅素）結(jie)合而成，是(shi)一種卟啉蛋(dan)白質。主酶無色糖(tang)蛋(dan)白在(zai)(zai)275nm波優點有(you)高(gao)吸(xi)(xi)收(shou)峰，輔基是(shi)深棕色的含(han)鐵卟啉環(huan)，在(zai)(zai)403nm波優點有(you)高(gao)吸(xi)(xi)收(shou)峰。HRP的純(chun)度(du)(du)用(yong)RZ(Reinheit Zahl，德(de)文，意為純(chun)度(du)(du)數(shu)）表示，是(shi)403nm的吸(xi)(xi)光度(du)(du)與280nm吸(xi)(xi)光度(du)(du)之(zhi)比，高(gao)純(chun)度(du)(du)的HRP的RZ≥7.0。
HRP除(chu)符(fu)合上述(shu)的(de)(de)(de)(de)ELISA中標(biao)記酶(mei)的(de)(de)(de)(de)要求外，更有價格低(di)廉和(he)性質較穩定的(de)(de)(de)(de)特點(dian)。值(zhi)得留意的(de)(de)(de)(de)是，在選用酶(mei)制劑(ji)時，除(chu)其(qi)純度RZ外，更應(ying)留意酶(mei)的(de)(de)(de)(de)活(huo)力(li)。高純度的(de)(de)(de)(de)酶(mei)如(ru)保存不當，活(huo)力(li)也會降低(di)。酶(mei)制劑(ji)的(de)(de)(de)(de)活(huo)力(li)以所含的(de)(de)(de)(de)酶(mei)活(huo)力(li)單位表示(shi)，可用對底物(wu)作(zuo)用后(hou)天生產物(wu)量的(de)(de)(de)(de)測定進(jin)行試驗。
國外(wai)很多ELISA試(shi)劑采(cai)用(yong)堿性磷酸(suan)酶(mei)(mei)（AP）作(zuo)為(wei)(wei)標記酶(mei)(mei)。常用(yong)的(de)AP有(you)兩個來(lai)源，分(fen)別從大(da)(da)腸桿(gan)菌和小(xiao)牛腸膜中提(ti)取。不同來(lai)源的(de)酶(mei)(mei)生化(hua)特性特性略不相同，從大(da)(da)腸桿(gan)菌中提(ti)取的(de)AP分(fen)子(zi)量(liang)為(wei)(wei)80000，酶(mei)(mei)作(zuo)用(yong)的(de)適(shi)合(he)pH為(wei)(wei)8.0；用(yong)小(xiao)牛腸膜中提(ti)取的(de)AP分(fen)子(zi)量(liang)為(wei)(wei)100000，適(shi)宜pH為(wei)(wei)9.6。在ELISA中，AP系統的(de)敏感(gan)度一般高于HRP系統，空(kong)缺值也較低，但AP價格昂(ang)貴，制備結合(he)物所(suo)得率也較HRP低。
制備結合物(wu)時(shi)所用(yong)抗體一般 均為(wei)純(chun)度較高(gao)(gao)的IgG，以(yi)免在與酶聯結時(shi)其他雜蛋白(bai)的干擾。用(yong)親和(he)層析(xi)純(chun)的抗體，這(zhe)樣全部酶結合物(wu)均具有特異的免疫活性(xing)，可(ke)以(yi)在高(gao)(gao)稀釋度進行反應，實(shi)驗結果本(ben)底(di)淺(qian)淡。如用(yong)F(ab)2進行標記，則更可(ke)避免標本(ben)中RF的干擾。在ELISA中用(yong)酶標抗原的模式未幾，總的要求是抗原必須是高(gao)(gao)純(chun)度的。
用(yong)于(yu)稀釋(shi)高濃(nong)度的(de)結合(he)(he)(he)物(wu)以配成工(gong)作液。為避(bi)免結合(he)(he)(he)物(wu)在(zai)反應(ying)中直接吸附(fu)在(zai)固相載(zai)體上，在(zai)稀釋(shi)緩沖液中常加(jia)進高濃(nong)度的(de)無關蛋白(bai)質（例(li)如1%牛血清白(bai)蛋白(bai)），通過競爭以抑制結合(he)(he)(he)物(wu)的(de)吸附(fu)。一般還加(jia)進具有抑制蛋白(bai)質吸附(fu)于(yu)塑料表面(mian)的(de)非離子型表面(mian)活性劑，如吐溫20，0.05%的(de)濃(nong)度較為適(shi)宜。在(zai)間(jian)接測(ce)定抗體時(shi)，血清標本需稀釋(shi)后進行測(ce)定，也可應(ying)用(yong)這種稀釋(shi)液。
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